下咽鳞状细胞癌中Beclin1、LC3的表达及其作用的初步研究

【摘要】下咽鳞状细胞癌(hypopharyngealsquamouscellcarcinoma,HSCC)是头颈部较常见的一种恶性肿瘤,发病率约占头颈癌的5%。早期症状主要表现为咽部异物感、吞咽梗阻感,随着瘤体增大,表面发生破溃,可引起吞咽疼痛、并出现同侧反射性耳痛,常伴有进行性吞咽困难,累及喉腔可引起声音嘶哑、呼吸困难等症状。因下咽癌中95%以上为鳞状细胞癌,大多数分化程度较差,易粘膜下浸润扩散,早期临床症状不明显,所以,在临床就诊时多数患者的病变已累及舌根、喉腔和颈段食道等部位,并多伴有颈部淋巴结转移。近年来随着头颈外科诊疗技术的不断发展,多种不同方法例如手术治疗、放射治疗、化疗药物治疗以及三种疗法相结合综合抗癌治疗的应用,HSCC患者生存率有所改善,但Ⅲ-Ⅳ期患者5年生存率仍仅为25%-40%。因此,深入研究HSCC的生物学特征,并在此基础上寻找肿瘤特异性标志物以及探索新的诊疗方法成为目前亟须解决的课题。自噬(autophagy)是细胞浆中出现大量由细胞膜包裹着部分胞质和细胞器的空泡结构(自噬体),溶酶体对空泡内的成分进行消化降解,并转变为机体所需的能量物质从而循环再利用的一种生物学现象。目前自噬至少可以分为三种形式,分别是微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬,通常我们所指的自噬为巨自噬。近年来研究表明自噬在肿瘤的发生、发展及转归过程中发挥着重要的作用,其对肿瘤细胞的影响及其分子机制一直存在着争议,自噬可在营养剥夺的条件下促进细胞的存活,起到保护细胞的作用,但在一定刺激条件下自噬被诱导时却可导致细胞死亡。目前在酵母中已经鉴别出大约30个特定基因参与自噬调控,其中人类同源的有16个,在这些基因中,Beclin1和LC3(microtubule-associatedprotein1A/1B-lightchain3,微管相关蛋白1轻链3)在哺乳动物细胞自噬过程中起着关键的作用。Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳动物中的同源类似物,主要通过与ClassIIIPI3K形成复合物参与自噬体的形成。Liang等人报道了在乳腺癌组织中Beclin1表达水平显著降低,将Beclin1转染人乳腺癌MCF7细胞株造成Beclin1稳定高表达,从而抑制癌细胞体外增殖活性,在体内试验中裸鼠成瘤能力也明显受到抑制,因此,Beclin1在人乳腺癌中具有抑癌作用。Clelia等研究揭示了在人恶性黑色素瘤细胞中Beclin1蛋白表达水平较正常皮肤黑素细胞显著降低。此外,Beclin1表达下调预示着自噬缺陷,与肝癌的恶性表型和预后不良密切相关。在卵巢癌、肺癌和脑神经胶质瘤等实体瘤中同样也存在Beclin1等位基因的缺失。但是,在已观察到的95%肠癌和83%胃癌中Beclin1表达水平却明显增高,具有致癌的作用,由此可见Beclin1在不同肿瘤中发挥的作用各不相同。LC3(microtubule-associatedprotein1A/1B-lightchain3,微管相关蛋白1轻链3)是酵母Atg8基因在哺乳动物细胞中的同源物,经Atg7和Atg3调节由泛素样加工修饰。LC3有三种亚型,包括LC3A、LC3B和LC3C,LC3由可溶型LC3-Ⅰ和脂化型LC3-Ⅱ组成,其分子量分别18kd和16kd。在面临各种应激情况下,例如缺氧、饥饿和化学药物作用下,细胞自噬被诱导,LC3-Ⅰ经泛素样加工和修饰,与膜表面的脂酰乙醇胺(PE)相结合成LC3-Ⅱ,其中LC3-Ⅰ存在于细胞浆,脂化的LC3-Ⅱ与自噬泡相结合,定位于胞内前自噬泡和自噬体膜表面。因此,LC3-II的含量与自噬泡的数量成正比,当细胞发生自噬时,LC3-Ⅱ上调。目前通过检测胞内LC3-Ⅱ表达的变化,从而可以判断自噬的状态,LC3-Ⅱ已被作为监测自噬活性的特异性标志物。Aoki等报道了Anti-LC3B抗体可以作为检测脑胶质母细胞瘤细胞系和组织中自噬的有效工具。近年来研究发现LC3在肺癌和宫颈鳞状细胞癌中呈现低表达并与患者预后不良相关,在这些肿瘤中LC3主要发挥抑癌作用。但在食道和胃肠道恶性肿瘤中LC3表达水平显著增高,提示可能起到促癌的作用。提示LC3在不同肿瘤中发挥的作用具有组织特异性。目前尚没有关于自噬相关基因在HSCC中表达及其作用的研究,在本项课题中,我们分别从mRNA、蛋白水平检测了自噬相关基因Beclin1、LC3在HSCC肿瘤组织和癌旁非肿瘤粘膜组织中的表达情况,并对病人进行追踪和术后随访,进一步分析研究Beclin1、LC3表达与下咽癌临床分期、病理分型以及疾病预后之间的关系。利用小干扰RNA技术在人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系中敲掉Beclin1,体外检测自噬相关基因Beclin1低表达对FaDu细胞凋亡、增殖和转移侵袭能力的影响。第一部分下咽鳞状细胞癌中自噬相关基因Beclinl和LC3的表达及其临床意义研究目的：研究自噬相关基因Beclin1和LC3在下咽鳞状细胞癌中的表达情况,并分析Beclin1和LC3表达与患者临床病理特征以及预后之间的关系。实验方法1.手术中收集82例HSCC肿瘤组织样本和54例距肿瘤手术切缘2cm以上形态学正常的癌旁非肿瘤粘膜上皮组织样本。2.采用免疫组织化学染色方法检测Beclin1和LC3分别在82例肿瘤样本和54例癌旁非肿瘤粘膜样本中的表达。3.TRIzol法用来提取54对相互配对的肿瘤组织和癌旁非肿瘤粘膜组织中总RNA,并反转录为cDNA,利用Real-timePCR方法比较在配对样本中Beclin1..LC3mRNA水平上的表达差异。4.使用蛋白裂解液从组织样品中提取总蛋白,应用WesternBlot方法在蛋白水平上定量检测Beclin1和LC3在肿瘤组织和相对照的癌旁非肿瘤粘膜组织中的表达情况。5.应用GraphPadPrism5.0和SPSS18.0统计分析软件。Beclin1和LC3相对表达量用mean±SEM表示,配对Wilcoxon符号秩和检验被应用于比较肿瘤组织与配对癌旁非肿瘤粘膜组织中Beclin1和LC3表达的差异。应用Spearman检验肿瘤组织中Beclin1和LC3之间的相关性,Beclin1、LC3的表达与HSCC临床病理特征之间关系的分析采用卡方检验或Fisher精确检验。采用非参数Kaplan-Meier分析法绘制生存曲线,其差异分析采用log-rank检验。应用多因素Cox回归模型分析影响HSCC患者生存时间的独立危险因素。所有统计学分析均为双侧,P<0.05时表示差异具有统计学意义。实验结果：1.免疫组织化学染色结果显示Beclin1阳性表达见于细胞膜和细胞质,但主要表达在细胞膜。LC3阳性表达主要在细胞质和细胞核,极少量表达在细胞膜。Beclin1在79.6%(43/54)的癌旁非肿瘤粘膜组织中表达阳性,但仅在42.7%(35/82)的肿瘤组织样本中阳性表达(P<0.0001)。LC3在74.1%(40/54)的癌旁非肿瘤粘膜组织样本中高表达,而仅在41.5%(34/82)的肿瘤组织样本中呈现出高表达(P=0.0002)。Beclin1和LC3在HSCC肿瘤组织中的表达显著低于相对照的癌旁非肿瘤粘膜组织。2.Real-timePCR结果显示Beclin1mRNA水平在肿瘤组织中相对表达量为(0.016±0.004),明显低于配对的癌旁非肿瘤粘膜组织(0.024±0.005,P<0.0001)。LC3-ⅡmRNA水平在肿瘤组织和癌旁非肿瘤粘膜组织中相对表达量均值分别为(0.154±0.053)和(0.242±0.083),统计学分析表明：与癌旁非肿瘤粘膜组织相比,LC3-ⅡmRNA水平在肿瘤组织中的表达显著降低(P=0.0001)。此外Beclin1和LC3-Ⅱ在肿瘤组织中存在正相关性(r=0.51,P<0.0001；95%CI：0.273to0.689)。3.Westernblot结果表明Beclin1在肿瘤组织样本中蛋白水平的相对表达量为(0.308±0.031),明显低于在癌旁非肿瘤粘膜组织中的表达(0.569±0.068,P＝0.02)。LC3-Ⅱ蛋白水平在肿瘤组织中的相对表达量是(0.289±0.034),显著低于相对照的非肿瘤粘膜组织(0.685±0.076,P=0.004)。4.Beclin1阴性表达与肿瘤高等级的临床分期(r=0.299,P＝0.005)、肿瘤大小(r=0.365,P=0.0004)、较低的分化程度(r=0.392,P＝0.0006)和颈部淋巴结转移(r=0.302,P＝0.004)有关。LC3低表达与肿瘤的大小(r=0.245,P=0.022)、较低的分化程度(r=0.504,P<0.0001)和颈部淋巴结转移(r=0.275,P=0.01)有关系。5.Beclin1阴性表达病例组总体生存率显著低于其阳性表达病例组(P<0.0001),LC3低表达组患者总体生存率相比于LC3高表达组显著降低(P=0.0145)。单因素Cox回归模型分析结果显示肿瘤的临床分期(P=0.0009)、颈部淋巴结转移(P=0.0007)、肿瘤大小(P＝0.0038)以及Beclin1的表达(P<0.0001)、LC3表达水平(P=0.018)均与总体生存率有关。采用多因素Cox回归模型分析显示自噬相关基因Beclin1的表达是影响HSCC患者预后的独立危险因素。实验结论：自噬相关基因Beclin1和LC3在HSCC中表达显著降低,这种异常表达与HSCC肿瘤的临床分期、分化程度以及颈部淋巴结转移等临床病理特征有关。Beclin1阴性表达和LC3低表达与患者预后不良相关,此外,Beclin1是影响HSCC患者总体生存率的独立预后因素,这些结果提示自噬相关基因可能成为治疗HSCC的新靶向分子。第二部分敲掉Beclin1对下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系凋亡及增殖的影响研究目的：将Beclin1-siRNA转导入人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系中,从而研究敲掉Beclin1对FaDu细胞系凋亡、增殖和转移侵袭能力的影响。实验方法：1.采用脂质体法(lipofectamine2000)将Beclin1-siRNA转染到人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系中,通过Real-timePCR和Westernblot方法检测Beclin1-siRNA的转染效率。采用Westernblot方法检测LC3-II蛋白水平在各实验组细胞中的表达情况。2.应用AnnexinV-APC单染法流式细胞仪检测敲掉Beclin1对FaDu细胞凋亡的影响。3.利用MTT方法检测Beclin1-siRNA转染FaDu细胞后,造成Beclin1低表达对细胞增殖活性的影响。4.采用Transwell侵袭实验检测Beclin1-siRNA对FaDu细胞系转移侵袭能力的影响。实验结果：1.脂质体法(lipofectamine2000)将Beclin1-siRNA转染入人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系后,瞬时转染效率可达70%。Real-timePCR和Westernblot方法结果显示与阴性对照组相比,Beclin1-siRNA转染组细胞中Beclin1表达显著降低(P<0.05),即Beclin1-siRNA可以引起Beclin1在FaDu细胞中的表达下调。我们通过Westernblot方法进一步检测LC3-Ⅱ在各实验组细胞中的表达情况,结果显示与阴性对照组相比,Beclin1-siRNA转染组FaDu细胞中LC3-Ⅱ的表达明显降低(P0.003)。2.AnnexinV-APC单染法检测细胞凋亡,结果显示Beclin1-siRNA转染组和阴性对照组细胞凋亡率分别是17.11±0.46%和4.773±0.3%,通过统计学分析,与阴性对照组相比,FaDu细胞系经Beclin1-siRNA转染后细胞凋亡数显著增加(P=0.001)。3.MTT方法结果表明与空白对照组和阴性对照组相比较,敲掉Beclin1后在96h内FaDu细胞增殖未见明显差异(P>0.05),即Beclin1低表达对FaDu细胞增殖活性的影响无统计学意义。4.Transwell实验结果显示空白对照组、阴性对照组和Beclin1-siRNA转染组中进入小室的FaDu细胞转移率分别是1.844±0.035、1.918±0.029和3.306±0.362,差异具有统计学意义(P=0.02),即与对照组相比,Beclin1-siRNA转染组细胞的转移侵袭能力明显增强。实验结论：通过Beclin1-siRNA转染人下咽鳞状细胞癌FaDu细胞系从而敲掉Beclin1,可抑制细胞自噬。与对照组相比,Beclin1(?)低表达可诱导FaDu细胞凋亡,并增强其转移侵袭能力,但对细胞增殖活性无明显影响。
【作者】王娟；
【导师】潘新良；
【作者基本信息】山东大学，耳鼻咽喉科学，2014，博士
【关键词】下咽鳞状细胞癌；自噬；Beclin1；LC3；预后；Beclin1-siRNA；凋亡；增殖；侵袭；

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